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    使用Nanophotometer®进行核酸定量的良好操作实践

    核酸定量是包括qPCR,NGS在内的部分生命科学实验流程的重要步骤, Nanophotometer®作为核酸定量的常用仪器,可选择测量所有类型的核酸,包括双链DNA、单链DNA、RNA、miRNA和寡核苷酸,还可选择输入miRNA和寡核苷酸序列作为自定义消光系数的测量方法。以及测量荧光标记的核酸及染料的吸光值,例如作为微阵列工作流程中的质量控制步骤,染料浓度和标记率将自动计算和显示。

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    为了获得准确性和一致性好的测量数据,我们建议用户采取以下良好操作实践:

    1,确认所测量的核酸样品种类,选择正确对应的样品类型和消光系数。

    2,使用无尘纸清洁样品台(底部窗口和顶部反射镜),不建议使用擦镜纸,多数的擦镜纸吸水性较差。请正确擦拭样品台和反射镜,而非将无尘纸垫在样品台上,这样往往会导致样品残留。

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    3,如果底座有样品残留或污染,在底座上滴5μl纯水,并关闭上盖浸泡一段时间,期间可点击空白测量(光程的快速切换可起到冲洗作用)然后彻底擦拭底座和反射镜。

    4,空白溶液应与与用于洗脱/溶解样品的缓冲液相同,如常用的10 mM Tris-HCl缓冲液。

    5,对于低浓度的样品,建议使用低吸附的样品管和吸头,将测量准确性和重复性。移取样品前,可使用样品润洗吸头2-3次,再行移取样品。

    6,为了确定空白溶液的质量,可执行回测操作,以空白溶液作为样品进行测量,通常可接受的标准为吸光值≤±0.05。

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    7,使用内置涡旋混匀器或适当拍打样品管,使样品均一化,这是准确测量的前提。

    8,使用底座的LED灯确认样品位置正确,也可用于气泡观察。

    9,如果使用含有洗涤剂(如吐温或Triton)的缓冲液,建议启用“气泡识别”功能

    10,如果样品浓度<10 ng/µl,则可重复测量取用平均值,减小相对误差的影响。

    11,检查260/230、260/280比率和污染物的完整光谱图数据。Sample Control功能将对有问题的样品进行标记,点击标记可获得详细信息。

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    12,当测量高浓度样品后,或者当一个样品测量结束后,请清洁样品台。

    13,测量结束后,请勿在样品台和上盖之间垫纸,设备样品台为封闭式,本身具备防尘设计。

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    测量过程中的重要提示:

    提示内容:气泡,细屑残留或样品质量差。请重新添加样品。

    原因及处理:气泡识别功能打开时,如检测到气泡、纸屑等残留物或不适宜的样本,如混浊样本,将显示该信息。请检查样品,彻底清洁底座样品窗和上盖反射镜,并重新滴加样品。为避免气泡,建议通过反向移液进行取样。气泡识别关闭时,所显示该信息将不包含气泡。

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    提示内容:在{250 - 280 nm,

    280 - 340 nm, 340 - 400 nm,

    400 - 475 nm, 475 - 550 nm,

    550 - 625 nm, 625 - 700 nm }处有高吸光度值。差的空白或样品台需要清

    原因及处理:当空白测量检测到对应波长段区域的较高吸光值时,将显示该信息。警告信息显示吸光度出现的波长范围。在空白测量中,两个因素可能会导致高吸光度:空白溶液/缓冲液在该波长范围内具有吸光值,或样品窗口、反射镜没有被完全的清洁。请将基座上的样品窗和反射镜彻底清洗,并检查空白溶液的吸光度(用空白的水、空白缓冲液作为样品)。

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    提示内容:在指定波长处达到最大吸光度水平。计算可能导致低/错误的结果。

    原因及处理:所用样品的浓度过高,超过规定的吸光度范围。微量体积的最大吸光度为330 A(10 mm路径),比色皿测量的最大吸光度为2.65 A。请适当稀释样品并再次测量。


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